Introducción

Los polisacáridos son polímeros biológicos abundantes compuestos por monosacáridos o azúcares. Como una clase diversa de materiales de origen natural, los polisacáridos se han utilizado en aplicaciones que van desde la fabricación de papel y algodón, hasta la bioimpresión y la bioingeniería, así como en productos farmacéuticos, agentes gelificantes en alimentos y otros productos de consumo.

Para producir estos artículos, los fabricantes e investigadores deben ser capaces de aislar e identificar polisacáridos con propiedades moleculares específicas, como el peso molecular, la viscosidad intrínseca y el tamaño molecular, que sean adecuados para cada aplicación específica. Por lo tanto, el análisis preciso y la caracterización del peso molecular de los polisacáridos son esenciales.

La cromatografía de permeación en gel (GPC), o cromatografía por exclusión de tamaño (SEC), es una técnica ampliamente utilizada para caracterizar una variedad de macromoléculas, desde materiales fabricados en masa hasta polímeros naturales y proteínas. Esta técnica permite medir los momentos del peso molecular (Mw, Mn), la dispersidad (Mw/Mn), la viscosidad intrínseca (IV) y el radio hidrodinámico (RH) de estas macromoléculas. La Figura 1 muestra la configuración completa del sistema GPC/SEC OMNISEC de Malvern.

Resumen breve de cómo funciona GPC/SEC:

Una muestra solubilizada es transportada por una fase móvil líquida a través de una columna analítica llena de partículas de gel poroso. En este proceso ocurre una separación controlada por difusión de los componentes macromoleculares, que finalmente se detectan a medida que cada fracción de la muestra eluye. Las muestras eluyen en función de su tamaño molecular, con las moléculas más grandes eluyendo primero. Es importante recordar que el orden de elución se basa en el tamaño molecular y no en el peso molecular.

Un sistema avanzado de GPC/SEC con detección múltiple típicamente incluye:

• Índice de refracción (RI).

• Viscosímetro.

• Detectores de dispersión de luz.

• A veces, un detector fotodiodo de UV/Vis.

Esta nota de aplicación describe el análisis de tres muestras de polisacáridos utilizando GPC/SEC con detección avanzada. Se realizarán comparaciones entre las tres muestras para destacar las ventajas de la detección avanzada sobre los métodos convencionales con un único detector.

Figura 1: Sistema GPC/SEC de detección Tetra OMNISEC de Malvern.

Resultados de GPC/SEC

Tres muestras de polisacáridos, denominadas 1, 2 y 3, se prepararon en agua a concentraciones de aproximadamente 0.5 mg/mL para el análisis de GPC/SEC utilizando una fase móvil de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las muestras se analizaron empleando dos columnas Malvern A6000M y una columna A7000, a una velocidad de flujo de 0.75 mL/min y con volúmenes de inyección de 100 μL.

Los cromatogramas de triple detección para las muestras de polisacáridos se presentan en las Figuras 2–4. En estos:

• La señal del índice de refracción (RI) aparece en rojo.

• La señal del viscosímetro aparece en azul.

• La señal del detector de dispersión de luz en ángulo recto (RALS) se muestra en verde.

• La señal del detector de dispersión de luz en ángulo bajo (LALS) se presenta en negro.

• El logaritmo del peso molecular (LogMW) se representa como una línea en dorado.

Es importante señalar que el gran pico que excede la escala en la señal de RI se debe a que el disolvente de disolución de la muestra (agua) es diferente de la fase móvil utilizada (PBS).

Figura 2: Cromatograma de triple detector de la muestra 1.

Figura 3: Cromatograma de triple detector de la muestra 2.

Figura 4: Cromatograma de triple detector de la muestra 3.

Las tres muestras muestran una buena cromatografía, como lo evidencia el retorno de las señales de los detectores a la línea base y la disminución constante de la gráfica de LogMW a lo largo de los picos de las muestras.

Un examen preliminar del volumen de retención de cada muestra indica que la muestra 1 eluye al menor volumen de elución (el tiempo de elución más temprano), seguida por la muestra 2 y, finalmente, la muestra 3. Esta tendencia se resalta en la superposición de los cromatogramas de índice de refracción mostrada en la Figura 5.

Figura 5: Superposición de cromatogramas de índice de refracción de las muestras 1 (rojo), 2 (violeta) y 3 (verde).

Las conclusiones que se pueden sacar de esta comparación son que la muestra 1 posee el mayor tamaño molecular de las tres muestras, seguida de la muestra 2, y la muestra 3 tiene el tamaño molecular más pequeño. Es importante señalar que el término tamaño molecular se utilizó para hacer las comparaciones basadas en el orden de elución, no en el peso molecular. En muchos casos, el tamaño molecular y el peso molecular siguen las mismas tendencias, pero esto no es absolutamente cierto para todas las muestras.

Datos moleculares calculados
Para examinar estas muestras más a fondo, los datos de caracterización molecular para las muestras 1, 2 y 3 se muestran a continuación en la Tabla 1. Los valores presentados incluyen Mw, Mn, Mw/Mn, IV y RH. El dn/dc utilizado para el análisis fue 0.148, típico de los polisacáridos en medios acuosos. Se presentan los datos de tres inyecciones, junto con las desviaciones estándar relativas.

Tabla 1. Datos de caracterización molecular de las muestras 1, 2 y 3; Mw, Mn en Da.

Como se puede observar a partir de los datos numéricos, la tendencia del tamaño molecular observada a partir del orden de elución de las muestras se confirma con los valores del radio hidrodinámico (RH) calculados para cada muestra. La muestra 1 tiene un RH de aproximadamente 44 nm, la muestra 2 tiene un RH de aproximadamente 29 nm, y la muestra 3 tiene un RH de aproximadamente 21 nm. Sin embargo, la tendencia del peso molecular de las muestras es opuesta a la del tamaño molecular. Se encontró que la muestra 1 tenía un peso molecular de aproximadamente 608 kDa, la muestra 2 tenía un peso molecular de aproximadamente 676 kDa, y la muestra 3 tenía el peso molecular más alto, alrededor de 1,230 kDa. Si este análisis se hubiera realizado utilizando una calibración convencional, que depende de un detector de concentración único y una curva de calibración que determina el peso molecular en función del volumen de retención, la tendencia del peso molecular habría seguido la tendencia del tamaño molecular, proporcionando datos inexactos. El uso de detección avanzada, que emplea un detector de dispersión de luz para medir el peso molecular absoluto independientemente del volumen de retención, ofrece datos precisos de peso molecular y revela la verdadera naturaleza de estas muestras.

Datos de Mark-Houwink-Sakurada
Las aparentemente contradictorias tendencias del tamaño molecular y el peso molecular se visualizan mejor utilizando un gráfico de Mark-Houwink-Sakurada (MHS). El gráfico MHS muestra los datos de dos detectores, el viscosímetro (IV) y el detector de dispersión de luz (MW), en escalas logarítmicas para resaltar las diferencias o similitudes entre diferentes estructuras moleculares. Los gráficos MHS de las tres muestras se presentan en la Figura 6.

Figura 6: Superposición MHS de las muestras 1 (rojo), 2 (violeta) y 3 (verde).

Al colocar el IV en el eje y, el gráfico MHS ofrece esencialmente una vista de la densidad molecular para todo el rango de peso molecular de una muestra. Esto se debe a que las unidades de IV son dL/g, o volumen/masa. A medida que IV aumenta, la densidad molecular disminuye. Por lo tanto, en el gráfico MHS, los materiales más densos se encuentran en la parte inferior del gráfico. Como se esperaba según las diferencias en los datos moleculares calculados, las muestras 1, 2 y 3 tienen gráficos MHS diferentes. El ancho de los gráficos MHS corresponde al rango de distribución de peso molecular de cada muestra, particularmente el extremo de alto peso molecular a la derecha. La muestra 3 tiene el MW más alto, lo que corresponde al gráfico MHS que se extiende más a lo largo del eje x. Dado que la muestra 3 también tiene el RH más pequeño, es la más densa de las tres muestras, por lo que su gráfico está más cerca de la parte inferior de los tres (es fácil de recordar: los objetos con alta densidad se hunden, los objetos con baja densidad flotan). Lo opuesto es cierto para la muestra 1: tiene el MW más bajo (y la distribución de peso molecular más estrecha), por lo que el gráfico MHS de la muestra 1 es corto y termina en el valor más bajo de peso molecular a lo largo del eje x. Pero como la muestra 1 tiene el RH más grande, para acompañar el MW más bajo, la densidad molecular de la muestra 1 es la más baja de las tres, lo que coloca su gráfico MHS en la parte superior. La muestra 2 es intermedia en todos sus parámetros moleculares, y su gráfico MHS se sitúa de manera intermedia entre los de las muestras 1 y 3.

De esta manera, el gráfico MHS muestra cómo el RH y el MW están relacionados por la estructura del polisacárido. La muestra 3 tiene el RH más pequeño, a pesar de su alto MW, gracias a su estructura densa, mientras que la muestra 1 tiene el RH más grande a pesar de su menor MW, gracias a su estructura más abierta y expandida.

Conclusiones

Los datos en esta nota de aplicación muestran de manera elegante el beneficio más simple e importante de la detección avanzada en GPC. Aunque la calibración convencional se ha utilizado con éxito durante muchos años, la suposición subyacente de que el RH y el MW están ligados no es cierta. Esto es particularmente importante para polímeros nuevos y polímeros que son naturalmente altamente variables, como los polisacáridos, como se muestra aquí. La GPC con detector avanzado no solo puede medir el peso molecular absoluto, independiente del tamaño molecular y del volumen de retención, sino también caracterizar completamente las diferencias estructurales subyacentes entre muestras y moléculas.

La capacidad de determinar con precisión el MW, así como el IV y el RH, de los polisacáridos es fundamental para proporcionar a los investigadores y fabricantes la información necesaria para desarrollar y producir productos únicos para aplicaciones específicas. Este tipo de información puede ayudar a desarrollar productos mejores y más valiosos en textiles, productos farmacéuticos, alimentos, productos de consumo y otras industrias en las que se utilizan estos materiales.

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