Introducción.
La dispersión de luz dinámica (DLS en inglés) no solo es capaz de medir partículas de un tamaño menor a 1 nm, sino que también es especialmente sensible a las partículas más grandes, debido a la relación de la sexta potencia que existe entre el radio de la partícula y la intensidad de la dispersión.
Esto significa que, por lo general, la preparación de la muestra se debe realizar de manera meticulosa, en especial para muestras de baja dispersión, como proteínas y moléculas biológicas. El aporte de contaminantes, como polvo y agregados, puede mitigarse mediante el filtrado. Sin embargo, esta solución no siempre resulta práctica o viable, dado que dependerá del volumen y la fragilidad de la muestra. El filtrado de las muestras también constituye una carga financiera, tanto en términos de tiempo adicional para la preparación de la muestra, como en costos de insumos. Se denomina Correlación Adaptativa al nuevo proceso de captura de datos DLS, que utiliza un abordaje estadístico para generar los mejores datos de correlación, que brindan, a su vez, mayor confiabilidad en los datos de tamaño, reduciendo la necesidad de filtrado y aportando mayor confianza en los resultados de DLS.
El algoritmo se puede aplicar a todas las muestras sujetas a medición por DLS, si bien, a fin de demostrar el abordaje, analizaremos las mediciones de lisozima de huevo de gallina, que presenta un desafío por tratarse de una muestra pequeña, de baja dispersión y con tendencia a agregados.
¿Qué es la Correlación Adaptativa?
La Correlación Adaptativa (CA) consiste en un nuevo abordaje que se propone capturar y procesar datos de DLS a fin de obtener gran exactitud en la función de correlación para lograr precisión al determinar el coeficiente de difusión y el tamaño de partícula.
Además de emplear un método estadístico para capturar la cantidad óptima de datos en el menor tiempo posible, la CA también utiliza modelos estadísticos para resaltar cualquier dato capturado que no sea representativo de la muestra, como el resultante de una partícula de polvo poco frecuente que circula por el volumen de la medición a detectar.
Si bien la CA no consiste en un filtrado por tamaño y no es capaz de discriminar de forma genuina las muestras multimodales, permite la caracterización de componentes de tamaño consistente o de estado estacionario sin distorsionar los datos con dispersiones intermitentes o transitorias. Este abordaje significa que no solo se ha mejorado la tolerancia al polvo, sino que las mediciones resultan más rápidas y logran mejorada repetibilidad, incluso para las muestras limpias y estables.
Mediciones más rápidas sin concesiones.
Al igual que en el abordaje estadístico para la identificación de eventos transitorios de dispersión, el proceso de mediciones de CA también ha cambiado. Originalmente, se registraban los datos de correlación durante el mayor tiempo posible a fin de suprimir y equilibrar cualquier fuente de ruido y perturbación. Con CA, es posible realizar varias sub-corridas cortas y promediar las funciones de correlación resultantes para alcanzar este objetivo. En definitiva, esto aumenta la repetibilidad de la medición al compararse con mediciones de igual duración, pero utilizando sub-corridas más extensas.

[Referencias:
Eje y: Intensidad (porcentaje); eje x: Tamaño (d.nm)]

[Referencias:
Título: Distribución del tamaño según la intensidad
Eje y: Intensidad (porcentaje); eje x: Tamaño (d.nm)]
Figura 1: Distribución del tamaño de partícula ponderada por intensidad para una dispersión de 1 mg/ml de lisozima. Las cifras de la parte superior e inferior muestran mediciones repetidas de la misma alícuota de muestra realizadas con y sin CA, respectivamente.
Con este nuevo proceso, se evalúa la calidad de los datos durante la medición, y solo se registran datos adicionales si los mismos aumentan la confianza en los datos de tamaño que finalmente se informan. Este proceso refleja un tiempo de medición de hasta tres veces más rápido que los métodos de correlación alternativos.
La Figura 1 muestra las distribuciones del tamaño de partícula para mediciones repetidas de la misma muestra de lisozima, realizas con y sin CA. Las mediciones realizadas sin CA no logran definir correctamente la distribución principal del tamaño de partícula, y la posición varía entre las mediciones repetidas, mientras que el resultado de la correlación adaptativa es repetible sin la presencia de un material de partículas de gran tamaño. Sin CA sería difícil calcular el tamaño del monómero y es probable que se necesite repetir la preparación y la medición de la muestra.
Menor tiempo y esfuerzo en la preparación de la muestra
Debido a la sensibilidad de la técnica DLS al material de gran tamaño, se recomienda filtrar los dispersantes y, en algunos casos, también la muestra con filtros del menor tamaño de poro posible a fin de obtener un filtrado óptimo. Sin embargo, esto puede tornar más compleja la preparación de la muestra e implica un costo financiero, dado que los filtros para jeringas de 20 nm rondan los 10 dólares cada uno.
Para una muestra de proteína, quizás también sea necesario filtrarla después de dispersar la proteína seca, a fin de medir una dispersión monomodal, ya que es posible que la lisozima no esté completamente dispersa y el uso de energía de dispersión excesiva puede formar agregados. Con un tamaño hidrodinámico esperado de 3,8 nm, un filtro de 20 nm representa la mejor opción. La Figura 2 muestra las distribuciones del tamaño de partícula para alícuotas filtradas con filtros de tamaño de poro de 100 nm y de 20 nm. Los datos se capturaron mediante el nuevo algoritmo de CA y un algoritmo alternativo de “rechazo de polvo”.
Estos datos indican que, si bien pueden producirse picos monomodales con una posición media consistente utilizando un filtro de 20 nm y el algoritmo alternativo, la correlación adaptativa produce resultados repetibles y de mejor resolución para la misma muestra, pero utilizando un filtro de 100 nm. La alícuota de la muestra filtrada con 100 nm, y medida a través del algoritmo alternativo de rechazo de polvo muestra picos de tamaño a lo largo de varias posiciones, y ambas mediciones que emplean el algoritmo alternativo muestran componentes pequeños mayores a 1 µm, que probablemente sean artefactos de ruido en esta instancia.

[Ref. Correlación Adaptativa con filtro de 100 nm; Algoritmo de rechazo de polvo con filtro de 20 nm; Algoritmo de rechazo de polvo con filtro de 100 nm]


Figura 2: Distribución del tamaño de partícula ponderada por intensidad para muestras de 1 mg/ml de lisozima dispersadas en un buffer de acetato con pH de 4.0, filtradas después de la dispersión con filtros de jeringa de diferente tamaño de poro y con captura de diferentes procesos de medición.

¿Qué tan profundo debe ser el filtrado?
Si bien no se trata de una técnica común de preparación de la muestra, existe mayor tolerancia al material agregado si se mezclan las muestras filtradas y las no filtradas, variando así la proporción de agregados presentes en la muestra.
Los datos de la Figura 3 surgen de medir la dispersión no filtrada de lisozima en primer lugar, la que fue agitada mediante mezclado excesivo durante la dispersión, y luego de preparar alícuotas parcialmente filtradas con un filtro de 20 nm. Después, se midió cada alícuota 5 veces utilizando el sistema Zetasizer Nano ZSP, que emplea un algoritmo diferente de “rechazo de polvo” y el Zetasizer Ultra con CA.
Ambas mediciones de la muestra filtrada arrojan un alto promedio z, lo que indica una fuerte presencia de material agregado; sin embargo, los resultados obtenidos con la CA muestran mejor repetibilidad.
La CA también puede arrojar un promedio z confiable y repetible con mínimo filtrado, pero la proporción de agregados tuvo que reducirse 16 veces para que el algoritmo alternativo pudiera reportar un tamaño de partícula aceptable.

[Ref. Eje y: Promedio z (nm); eje x: Proporción relativa de agregados. Correlación adaptativa versus Rechazo de polvo]
Figura 3: Tamaño de partícula promedio z informado para muestras de lisozima, filtradas con diferentes proporciones medidas a través de algoritmo alternativo de rechazo de polvo y CA. La proporción de 1 en el eje x representa una muestra agregada y no filtrada. Los puntos de datos representan el valor medio de 5 mediciones repetidas, con desvíos estándar representados como barras de error.
Conclusión
Al utilizar análisis estadístico y un proceso optimizado de recolección de datos, la Correlación Adaptativa ofrece una mejora en la repetibilidad de las mediciones DLS del tamaño de partícula y la capacidad de medir tamaños de partículas primarias de forma separada de la caracterización de infrecuentes cantidades de material agregado. Estas mejoras redundan en mediciones más rápidas y de mayor precisión con menor necesidad de filtrado de muestras y dispersantes, lo que significa que se pueden utilizar procedimientos simplificados para la preparación de la muestra y que existe el potencial de reducir los costos de los insumos de laboratorio.

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